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2023-07-26 10:19发布

做好Western需要注意各种细节。工欲善其事,必先利其器,首先还是从蛋白提取开始谈起。 1.收样前3min先配制细胞裂解液(现配现用),RIPA:蛋白酶
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1楼 · 2023-07-26 10:39.采纳回答

做好Western需要注意各种细节。工欲善其事,必先利其器,首先还是从蛋白提取开始谈起。

1.收样前3min先配制细胞裂解液(现配现用),RIPA:蛋白酶抑制剂:磷酸酶抑制剂=99:1:1。6孔板收集蛋白每孔需200ul,计算用量。以收集六孔蛋白为例,按比例加入RIPA 1200ul,蛋白酶抑制剂12ul,磷酸酶抑制剂12ul,混匀后置于冰上。(我使用的试剂RIPA裂解液(中),蛋白酶抑制剂混合物(100×),蛋白磷酸酶抑制剂混合物(100×)均购自***公司)
2.弃掉旧的培养基,PBS洗三遍。
3.每孔加入200ul刚配好的裂解液,立即置于冰上,在摇床上裂解30min。

(全程在冰上操作)
1.将动物组织(脑、肺等)取出后分装成三份或更多(一份WB,一份qPCR,一份备用),取出后立即存于-80℃。(注:取完一块组织后立即冻存于-80℃,反复冻存样品对待测蛋白有影响,最好用新鲜样品实验)
2.配制细胞裂解液(现配现用),组织:RIPA=1mg:10ul,可根据实际情况调整。RIPA:蛋白酶抑制剂:磷酸酶抑制剂=99:1:1。配好后置于冰上。
3.将其中一份组织剪下约90mg于有钢珠的震荡匀浆器中匀浆。此匀浆器的盖子或芯通常置于-20℃,使用时取出,操作应快捷,匀浆1min基本可保持温度。
4.将匀浆加入90ul现配的裂解液中,冰上摇床裂解30min。

我采用的是***公司的BCA蛋白定量试剂盒测定提取蛋白浓度,和说明书protocol差别不大,稍有不同,如下:
1.稀释BSA标准品以制作标准曲线:取7支EP管,每管加30ul生理盐水,第一管加30ulBSA,混匀后再取30ul至第二管,依次倍比稀释,最后一管不加为空白(即本底值)。则8个标准品的浓度分别为2ug/ul、1ug/ul、0.5ug/ul、0.25ug/ul、0.125ug/ul、0.0625ug/ul、0.03125ug/ul、0。

可提前配制:

戴好口罩和手套,选用1.0mm玻板,用试管刷和洗洁精仔细刷洗玻板,清水冲洗干净。卡槽对齐卡好后置于软橡胶垫片上,夹紧,向板中加满蒸馏水试板子是否漏液。观察几分钟后若不漏液,将板子中水倒出,倒扣晾干。

1.配制8ml 10%分离胶,依次向小烧杯中加入蒸馏水3.04ml,30%丙烯酰胺2.7ml,1.5M•pH8.8 2.0ml,10%SDS 80ul,10%AP 80ul,TEMED 3.2ul。加入TEMED混匀后立即灌胶,用1ml枪头沿着玻板上沿从左至右轻轻将胶打入,以免胶浓度不均匀,避免气泡产生。加完后换200ml枪头从左至右更加小心加入蒸馏水水封,以免冲散刚灌的分离胶。静置,当水和胶之间出现一条水平的折线时,即已凝固。
2.待分离胶凝固后,将水封的蒸馏水倒出,可将滤纸条放于玻板角吸水加快残留水流出,倒置。配制4ml 5%分离胶,依次向小烧杯中加入蒸馏水2.7ml,30%丙烯酰胺670ml,0.5M•pH8.8 500ul,10%SDS 40ul,10%AP 40ul,TEMED 4ul。加入TEMED混匀后立即灌胶,同上用1ml枪头从左至右轻轻加入浓缩胶,加满后冲洗10孔梳子,水平轻轻插入浓缩胶中静置待其凝固。可将剩余的浓缩胶沿着梳子加入玻板中以完全密封。
3.此时,可将之前分装好的煮过的加入loading buffer的蛋白样品、预染的蛋白maker 和一小支loading buffer 置于4℃融化。
Little Trick
1.AP和TEMED均为神经毒性、致癌物质,使用时需小心。
2.灌胶时视线与胶面水平,注意操作,避免胶溅入眼睛中。
3.常温下半小时胶可凝固,若天气寒冷或需加快凝固,可将其置于37℃孵箱中,15min左右即可凝固。
4.若第二天早上立即跑胶,这样就不耽误午饭时间,可头天晚上先把胶配好,凝固后取下玻板,连夹子、梳子一同放入蒸馏水中,4℃过夜保存。

1.将玻板卡紧电泳槽中,先在内槽加满已配好的1×电转液,十几分钟后观察是否漏液,若漏液重新调整玻板,再次卡紧,直至不漏液为止。否则,可能胶还没跑完,电转液就漏完了。
2.轻轻拔去梳子,第一孔加入5ul预染的蛋白maker ,2~7孔依次加入20ul待测蛋白样品,第8孔加入10ul提前融化的loading buffer。上样时轻轻加入,注意不要将样品加入其他孔,或加样过快导致样品溢出。
3.插好正负极,注意检查正负极不能插反。调节电压至80V(浓缩胶),跑0.5h后;将电压调至100V(分离胶),约1.5h后,maker分离明显,在胶底部出现一条蓝 {MOD}的buffer条带,此时电泳完毕。使用完在实验仪器使用本上做好登记。
注意:避免蓝 {MOD}条带跑出分离胶,这样有可能目的蛋白也已经跑出,所以在分离胶底部出现一条整齐水平的蓝 {MOD}条带时,即停止电泳。
Little Trick
1.电泳时插好正负极后,从电泳槽底会有小气泡上升,气泡的数目和上升速率与电压大小呈正比。若小气泡和往常不太一样,观察几分钟后还是如此,则需检查是否加错了电泳液,或者电泳液配制有误。
2.一般浓缩胶80V 0.5h,分离胶100~120V 1~1.5h,具体跑胶电压和时间与目的蛋白大小、实验仪器和实验室环境都有关,需多次探索最佳条件。若目的蛋白较小,则尽量缩短跑胶时间,并及时观察maker位置,避免目的蛋白跑出。我分别实验了浓缩胶80V 0.5h,80V 1h,分离胶120V 1.5h,120V 1h,100V 1.5h,100V 1h,110V 1.5h,110V 1h,结果显示在本实验室实验仪器下,我的目的蛋白及内参在浓缩胶80V 0.5h,分离胶100V 1.5h条件下,分离效果最好。在此条件下,我做了几次重复实验,结果均一致。因此,总结出本实验室此目的蛋白的最佳电泳条件。
3.电泳的好坏直接影响到目的蛋白的显影情况,尤其时磷酸化目的蛋白的二聚体,若电泳条件优化,结果可清晰显出蛋白表达情况。所以探索最佳电泳条件是决定胜负关键一步。
4.电泳快结束时即可准备转膜所需的滤纸和PVDF膜,浸泡在电转液中。建议在第一次WB后分别剪好不同大小的硬纸片,标好面积和孔数(即样品数),存好以后随时使用。
5.WB中夹取PVDF膜最好使用平头镊子,并夹住膜左上角,可最大程度减小对膜上蛋白的损害。

电泳结束后,取出玻璃板,稍微冲洗,洗净电泳槽,放好。轻轻撬开玻璃板,根据maker位置和目的蛋白分子量大小在玻璃板上切胶,为了防止切歪,可在玻璃板下垫上上述剪好的同切胶大小一致的硬纸片。一般一块胶需切下目的蛋白和内参两小块胶,将切下的胶分别浸泡在电转液中。

1.根据每一块切胶的大小剪6张同样大小的滤纸和一张PVDF膜,浸泡于电转液中,可以提前准备好的硬纸片为模板剪。PVDF膜先经甲醇活化20s后浸泡于电转液中。
2.在电转仪上制作“三明治”结构转移膜,最下面放三层滤纸,然后依次放PVDF膜,胶,三层滤纸,用玻璃棒轻轻赶走气泡(注意上下三层滤纸之间不能接触,否则易造成短路)。盖上盖子,根据膜的总面积调整电流,电转2h。
3.在电转的同时,可以配制以下液体,事先根据膜的数量计算好所需体积:
以一块膜为例,封闭5ml+稀释一抗4ml+稀释二抗4ml,需要13ml,则配制15ml。
5% BSA溶液(w/v):配制15ml 5% BSA溶液(w/v),称取0.75g BSA晶体,溶于15mlTBST中,漩涡振荡器混匀,现用现配,4℃保存(若目的蛋白为磷酸化蛋白时配制)。
5%牛奶(w/v):配制15ml 5%牛奶(w/v),称取0.75g脱脂奶粉,溶于15ml TBST中,漩涡振荡器混匀,现用现配,4℃保存。
1×TBST洗液:使用时将100×TBST用双蒸水稀释至1×,常温保存。
Little Trick
1.关于电转膜,有些使用NC膜。我没有尝试过NC膜,但隔壁实验室使用NC膜多次WB结果仍不理想,换用PVDF膜后有所改善。因此建议还是使用PVDF膜,可购买Millipore的PVDF膜,一卷有些贵,但是可以够一个实验室用好几年哪。最好不要在经销商购买分装的的PVDF膜,另一实验室一同学想着价格便宜也就只做几次,就从试剂公司只买了100cm2的膜,结果这价格虚高不说,而且膜还是假的,直到做完实验了才发现,蛋白样品也浪费了。所以建议还是购买Millipore公司原装的PVDF膜。
2.关于电转方式,有些采用湿转,有些采用半干转,两种方式均可。个人觉得半干转方便简捷些。

1.电转结束后,根据maker位置和目的蛋白及内参大小剪膜。可在标有maker的一边左上角剪一个小角,以清楚哪一条带是1号样品。
2.分别用已配好的5% BSA和5%牛奶封闭目的蛋白和内参,室温摇床上孵育2h。根据盒子大小,加入封闭液的量需没过膜。

1.配制p-STAT1一抗( 公司),1:500稀释,加入上述配制的5% BSA 4ml,再加入8ul p-STAT1一抗,混匀,现配现用。
配制actin一抗(
公司),1:2000稀释,加入上述配制的5%牛奶4ml,再加入2ul actin一抗,混匀,现配现用。
2.将PVDF膜从封闭液中取出,可用平头镊子小心放入塑料手套的手指中,加入一抗,封口,使膜完全浸泡在一抗中,放入冰箱,4℃过夜。我一般用封口膜做成小盒,置于大玻璃平皿中,放入PVDF膜,用枪从上到下向膜上加一抗,完全浸没,之后和PCR上样仪一同固定在摇床上,4℃孵育过夜。

次日,回收一抗,做好标记,-20℃保存,可再使用3~4次。将膜放入1×TBST中,摇床上清洗三次,每次10min。

1.配制具有种属特异性的HRP标记的二抗(抗鼠或抗兔),1:2000稀释,加入上述配制的5%牛奶4ml,再加入2ul 二抗,混匀,现配现用。
2.TBST洗完膜后,加入二抗,室温摇床上孵育2h。

1.二抗孵育完后,回收,-20℃保存。1×TBST摇床上洗膜三次,每次10min。
2.一条目的蛋白即一张膜需要100ul发光液A和100ul发光液B,根据膜数计算用量,提前4℃混合好发光液A和B。
3.到暗室中加混合好的发光液,在胶片左上角剪一小角(和PVDF膜一致),曝光胶片,可分别不同时长曝光,如15s,30s,1min,5min等,然后在显影液和定影液中显影,放入自来水中。出暗室后,将胶片挂起晾干。
也可用Bio-rad凝胶成像系统照相,选择不同的曝光时间成像。
Little Trick1.需通过不同曝光时间探索某蛋白最佳曝光时间,多次重复实验即可采用此曝光时长。我最开始也是在暗室中显影,后来用Bio-rad凝胶成像系统照相,对比结果发现后者的结果更加清晰明显,背景也更加干净,之后就一直用成像仪曝光照相了。
2.夹取胶片可用普通镊子,但也只夹胶片左上角,避免损害胶片上曝光的蛋白条带。
3.胶片左上角maker一侧一定要剪一小角或做其它标记,才可在显影后明显对应各个样品。
4.若暗室曝光,可能内参蛋白发光液刚加上就出现很亮的条带,这时最长曝光15s已经足够。

若显影效果不好,可将膜重生,再次显影,省去了配胶、电泳和电转等步骤。
1.加4ml蛋白印迹膜再生液,室温摇床30min。

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